Biologie · Verstehen und üben
Gezielt erkennen, DNA schneiden und Reparatur verstehen: Entdecke, wie CRISPR/Cas9 funktioniert und warum Ergebnisse sorgfältig geprüft werden müssen.
Bei der Genomeditierung wird die DNA an einer ausgewählten Stelle verändert. Ein Gen kann beispielsweise gezielt in seiner Funktion untersucht werden, indem seine Sequenz verändert wird. Das unterscheidet sich vom bloßen Vervielfältigen eines DNA-Abschnitts durch PCR. Auch das Einfügen eines Abschnitts in ein Plasmid ist zunächst ein anderer Arbeitsschritt.
CRISPR/Cas bezeichnet eine Gruppe von Werkzeugen, die aus Abwehrsystemen von Bakterien und Archaeen entwickelt wurden. Auf dieser Seite betrachten wir vor allem das verbreitete Cas9-Schneidemodell. Andere Cas-Systeme und weiterentwickelte Werkzeuge funktionieren teilweise anders.
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| Bestandteil | Funktion | Häufige Verwechslung |
|---|---|---|
| guide-RNA (gRNA) | Ein Abschnitt der RNA kann mit dem komplementären Zielabschnitt der DNA Basenpaare bilden; weitere Bereiche dienen der Bindung an Cas9. | Die gRNA ist nicht die DNA-Reparaturvorlage. |
| Cas9 | Ein Protein mit Nukleaseaktivität; es kann beide DNA-Stränge schneiden. | Cas9 ist kein Enzym, das automatisch jede gewünschte Ersatzsequenz einsetzt. |
| Zielbereich der DNA | Der Abschnitt, an den die RNA im geeigneten Komplex bindet. | Das Ziel kann innerhalb oder außerhalb eines Gens liegen. |
| PAM | Ein kurzes benachbartes DNA-Motiv, das zum eingesetzten Cas-System passen muss. | Die PAM gehört zur Ziel-DNA und nicht zur gRNA. |
| Reparaturvorlage, falls eingesetzt | DNA mit passender Ähnlichkeit, aus der eine gewünschte Änderung übernommen werden kann. | Ihre Anwesenheit garantiert nicht, dass jede Zelle sie nutzt. |
Die häufig verwendete natürliche SpCas9-Variante erkennt typischerweise eine PAM der Form NGG; N steht für eine beliebige Base. Andere Varianten haben andere Anforderungen. Für das Grundprinzip genügt: Passende RNA-DNA-Paarung und geeigneter Kontext müssen zusammenkommen. Die kurze PAM allein ist keine eindeutige Adresse im Genom.
Der Komplex prüft eine geeignete PAM und die Passung zwischen RNA und DNA. Cas9 und guide-RNA arbeiten dabei zusammen.
Bei geeigneter Bindung kann Cas9 beide Stränge schneiden. Damit ist zunächst ein DNA-Bruch entstanden, noch keine vollständig überprüfte Genomänderung.
Zelleigene Reparaturwege verbinden oder bearbeiten die DNA. Die ursprüngliche Sequenz kann wiederhergestellt oder verändert werden. Sequenz und Funktion müssen geprüft werden.
Bei Endverknüpfung, etwa NHEJ, werden Bruchenden ohne eine homologe Vorlage verbunden. Dabei kann die Sequenz erhalten bleiben; es können aber auch Einfügungen oder Verluste von Basen entstehen. Solche Indels können die Funktion beeinflussen.
Bei homologiegerichteter Reparatur (HDR) kann Information aus einer passenden DNA-Vorlage übernommen werden. Der Zellzustand und weitere Bedingungen beeinflussen den Vorgang. Unterschiedliche Zellen können unterschiedliche Ergebnisse liefern.
Wir vergleichen drei erfundene Kandidaten ohne reale Basensequenzen. Das Modell prüft nur zwei Kriterien: eine vollständige RNA-DNA-Passung und eine geeignete PAM. Es sagt keine reale Schnittwahrscheinlichkeit voraus.
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| Kandidat | RNA-DNA-Passung | PAM geeignet? |
|---|---|---|
| A | vollständig passend | ja |
| B | vollständig passend | nein |
| C | nicht vollständig passend | ja |
Wähle den Kandidaten, der beide Modellkriterien erfüllt.
Betrachte eine Veränderung innerhalb eines zusammenhängenden protein-codierenden Abschnitts. Das ursprüngliche Leseraster ist bekannt. Wir zeigen mögliche Ergebnisse, keine gemessenen Häufigkeiten.
Eine Base ist kein Vielfaches von drei. Nach der Stelle werden die Basen in anderen Dreiergruppen gelesen. Dadurch kann sich die nachfolgende Aminosäuresequenz ändern und ein vorzeitiges Stoppsignal entstehen.
Prüfen: Eine wahrscheinliche Funktionsstörung ist noch kein experimentell bestätigter vollständiger Funktionsverlust.
Das nachfolgende Leseraster bleibt erhalten. Die Proteinsequenz ist dennoch verändert; welche Aminosäuren genau betroffen sind, hängt von der Lage der Deletion ab.
Prüfen: Auch eine Veränderung ohne Rasterverschiebung kann die Funktion stark beeinflussen.
Die Auswertung zeigt im gedachten Beispiel eine Änderung nach der Reparaturvorlage. Nun sind die genaue Sequenz, mögliche weitere Veränderungen und die tatsächliche Funktion zu prüfen.
Prüfen: Ein gewünschtes Ergebnis in einer Zelle bedeutet nicht automatisch, dass alle behandelten Zellen gleich verändert sind.
Ein Knock-out bezeichnet den Funktionsverlust eines Gens; ein Knock-in eine gezielte Einführung oder Ersetzung von Sequenzinformation. Die Begriffe beschreiben beabsichtigte beziehungsweise nachgewiesene Ergebnisse. Ein Schnitt allein beweist weder das eine noch das andere.
Bewerte jeweils, wie weit die Aussage der vorliegenden Beobachtung reicht.
Genomeditierung hilft in der Forschung, die Funktion von DNA-Abschnitten zu untersuchen. Weitere Anwendungsfelder sind Pflanzenzüchtung und medizinische Verfahren an geeigneten Körperzellen. Ob ein bestimmter Einsatz sinnvoll ist, hängt von Ziel, Organismus, Folgen und verfügbaren Alternativen ab.
| Frage | Worauf kommt es an? |
|---|---|
| Ist die Änderung angekommen? | Nicht jede Zelle nimmt die benötigten Bestandteile auf oder verarbeitet sie gleich. |
| Ist die gewünschte Sequenz entstanden? | DNA-Analysen müssen das konkrete Ergebnis zeigen; Länge allein genügt häufig nicht. |
| Gibt es unerwünschte Änderungen? | Zu prüfen sind Off-Target-Effekte und unerwünschte Veränderungen direkt an der Zielstelle. |
| Ist die gewünschte Funktion erreicht? | Ein DNA-Befund ersetzt die Untersuchung von Genaktivität, Protein oder beobachtbarer Eigenschaft nicht. |
Weiterentwicklungen: Base Editing kann bestimmte Basen gezielt umwandeln; Prime Editing nutzt unter anderem eine RNA-gebundene Vorlage und eine reverse Transkriptase. Diese Werkzeuge benötigen typischerweise keinen gezielt erzeugten Doppelstrangbruch wie im hier gezeigten Cas9-Schneidemodell. Sie haben jeweils eigene Möglichkeiten und Grenzen. Mit katalytisch inaktiviertem Cas9 lassen sich außerdem regulatorische Funktionen an DNA-Stellen bringen, ohne dort wie gewöhnliches Cas9 zu schneiden.
Versuche jede Aufgabe zuerst selbst. Nutze bei Bedarf den Tipp und vergleiche erst danach mit der Lösung.
Vervielfältigen oder verändern?
PCR vervielfältigt einen ausgewählten DNA-Abschnitt. Genomeditierung verändert DNA an ausgewählten Stellen. PCR kann anschließend zur Analyse beitragen, ist aber selbst nicht dasselbe Verfahren.
Zielerkennung und Cas9-Bindung.
Ein RNA-Abschnitt unterstützt über komplementäre Basenpaarung die Erkennung der Ziel-DNA. Weitere Bereiche ermöglichen die Zusammenarbeit mit Cas9. Die RNA ist nicht automatisch eine Reparaturvorlage.
Benachbartes DNA-Motiv.
Die PAM ist ein kurzes, vom verwendeten Cas-System erkanntes Motiv in der DNA neben dem Zielbereich. Sie liegt nicht in der guide-RNA.
Die Adresse hat mehrere Bestandteile.
Eine kurze PAM kommt an vielen Stellen vor. Zusätzlich ist die Passung der guide-RNA zum Zielbereich bedeutsam; auch weitere Bedingungen beeinflussen die Aktivität.
Schnitt und Endergebnis trennen.
Zunächst ein Bruch in beiden DNA-Strängen. Eine bestimmte stabile Sequenzänderung entsteht erst im weiteren Verlauf und muss anschließend nachgewiesen werden.
Wird eine homologe Vorlage benötigt?
Endverknüpfung verbindet die Enden ohne homologe Reparaturvorlage und kann unveränderte oder veränderte Sequenzen liefern. Bei HDR kann Information aus einer passenden Vorlage übernommen werden.
Dreiergruppen betrachten.
Das Leseraster verschiebt sich hinter der Stelle. Die nachfolgende Aminosäurefolge kann sich ändern; ein vorzeitiges Stoppsignal kann entstehen. Der funktionelle Effekt muss geprüft werden.
Raster und Sequenz sind verschiedene Dinge.
Das nachfolgende Raster bleibt zwar erhalten, die Sequenz ist aber verändert. Auch ohne Rasterverschiebung können wichtige Bereiche betroffen sein und die Funktion beeinträchtigt werden.
Tabelle mit A, B und C.
A: vollständige RNA-DNA-Passung und geeignete PAM. Die vereinfachte Tabelle schließt reale Off-Target-Effekte bei anderen Kandidaten nicht sicher aus.
Gleiche Länge, andere Basen.
Verschiedene Sequenzen können dieselbe Länge besitzen. Der genaue DNA-Befund und bei Bedarf die Funktion müssen zusätzlich untersucht werden.
Eingriff oder Funktionsverlust?
Ein Schnitt ist ein molekulares Ereignis. Ein Knock-out ist ein Verlust der Genfunktion. Die Reparatur kann unterschiedliche Ergebnisse liefern, deshalb ist die Funktion gesondert zu prüfen.
Base Editing und regulatorische Anwendungen.
Manche Varianten verändern Basen oder beeinflussen Genaktivität, ohne wie gewöhnliches Cas9 einen gezielten Doppelstrangbruch zu erzeugen. CRISPR/Cas ist eine Werkzeugfamilie.
Welche Zuordnung ist richtig?
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