Biologie · Verstehen und üben

PCR: DNA gezielt vervielfältigen

Von der Primerbindung zur millionenfachen Kopie: Verfolge die drei Temperaturphasen und prüfe, was eine PCR leisten kann – und was Kontrollen zeigen müssen.

Das kannst du danach

PCR-Zyklen erklärenPrimer und Syntheserichtung zuordnenIdealrechnung und Kontrollen auswerten

Was macht eine PCR?

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) vervielfältigt einen ausgewählten DNA-Abschnitt im Reaktionsgefäß. Aus wenig Ausgangsmaterial entstehen viele Kopien, die anschließend untersucht werden können. Die PCR kopiert nicht automatisch das gesamte Erbgut.

Zwei kurze DNA-Stücke, die Primer, legen den gewünschten Bereich fest. Sie passen zu Sequenzen an seinen beiden Rändern. Ein Thermocycler wechselt wiederholt zwischen Temperaturen für Trennung, Primerbindung und Verlängerung.

Gezielt statt alles kopieren

Blau: vorhandene DNA. Violett: zwei Primer. Ihre freien 3′-Enden zeigen in den Zielbereich. Die Primer werden Teil der entstehenden DNA.

Amplifikation bedeutet Vervielfältigung. Das vervielfältigte Produkt heißt Amplicon. Seine Länge wird gewöhnlich in Basenpaaren (bp) angegeben.

Für die Primerwahl muss man die flankierenden Sequenzen kennen. Die innere Sequenz muss dagegen nicht vollständig bekannt sein. Ein passendes Primerpaar sorgt dafür, dass überwiegend der beabsichtigte Abschnitt vervielfältigt wird.

Was gehört in den Ansatz?

Bestandteil	Warum wird er gebraucht?
DNA-Vorlage	Enthält den Abschnitt, der kopiert werden soll.
Zwei DNA-Primer	Binden an gegenüberliegende Matrizen und stellen freie 3′-OH-Enden bereit.
Hitzestabile DNA-Polymerase	Verlängert die Primer, zum Beispiel Taq-Polymerase.
dNTPs	Die vier DNA-Bausteine dATP, dTTP, dGTP und dCTP.
Puffer mit geeigneten Ionen	Sichert passende Bedingungen; Magnesiumionen sind für die Polymerase wichtig.

Unterschied zur natürlichen Replikation

In der üblichen PCR ersetzt Hitze das Öffnen durch die Helicase. Bereits zugesetzte DNA-Primer ersetzen die Primerherstellung durch die Primase. Neue DNA wächst auch hier immer 5′→3′.

PCR-Zyklus: den Ablauf Schritt für Schritt verfolgen

Wechsle zwischen den drei Schritten. Die Zeichnung verfolgt dieselben zwei Matrizen. Blau steht für vorhandene DNA, Violett für Primer, Grün für neu ergänzte DNA. Die gelben Formen mit P zeigen die Polymerasen.

Denaturierung

Bei etwa 95 °C lösen sich die Basenpaarungen: Die beiden DNA-Stränge werden getrennt. Das Zucker-Phosphat-Rückgrat bleibt erhalten.

Warum braucht jeder Schritt seine Temperatur?

Denaturierung · etwa 95 °C

Die Doppelstränge trennen sich. Es entstehen keine neuen Basenfolgen; die vorhandenen Stränge werden als Matrizen zugänglich.

Annealing · häufig 50–65 °C

Die Primer binden komplementär an passende Stellen. Die geeignete Temperatur hängt vom Primerpaar ab: zu niedrig begünstigt Fehlbindungen, zu hoch kann die Bindung verhindern.

Elongation · bei Taq häufig 72 °C

Die Polymerase ergänzt DNA-Bausteine am 3′-Ende des jeweiligen Primers. Aus zwei Matrizen entstehen wieder Doppelstränge. Andere Polymerasen können andere Optimaltemperaturen haben.

Diese Schritte werden typischerweise über viele Zyklen wiederholt. Neue Kopien dienen in der nächsten Runde selbst als Vorlagen: Dadurch entsteht die Kettenreaktion. Die genannten Temperaturen sind typische Schulbeispiele, kein universelles Laborprotokoll.

Wie schnell nimmt die DNA-Menge zu?

Bei idealer Verdopplung pro Zyklus gilt N = N₀ · 2ⁿ. N₀ ist die Ausgangszahl der Doppelstrang-Vorlagen, n die Zahl der Zyklen. Aus einer Vorlage werden idealisiert nach zehn Runden 2¹⁰ = 1024 Doppelstrangprodukte.

Zyklen: 10

1.024

1 · 2¹⁰ = 1.024 Doppelstrangprodukte im Idealmodell

Das Modell hat Grenzen

In den ersten Runden können Produkte über den Zielbereich hinausragen. Doppelstränge mit beidseitig exakt definierter Ampliconlänge entstehen ab dem dritten Zyklus. Die Formel 2ⁿ zählt hier alle idealisierten Doppelstrangprodukte, nicht ausschließlich diese exakten Amplicons.

In der Praxis beträgt die Effizienz nicht dauerhaft 100 %. Reagenzien werden knapp und Produkte reichern sich an: Die Reaktion erreicht eine Plateauphase. Nach 30 Runden sagt die Idealrechnung daher keine verlässlich gemessene Ausbeute voraus.

Ergebnis prüfen: Kontrollen gehören dazu

Ansatz	Erwartung und Bedeutung
Positivkontrolle	Bekannte Ziel-DNA wird mitgeführt. Das erwartete Produkt zeigt, dass die Reaktion unter diesen Bedingungen funktionieren kann.
Negativkontrolle ohne DNA-Vorlage	Darf kein Zielprodukt liefern. Ein solches Produkt kann auf Verunreinigung hinweisen.
Unbekannte Probe	Ihr Ergebnis wird erst zusammen mit den Kontrollen beurteilt. Kein sichtbares Produkt kann auch an Hemmstoffen, zu wenig DNA oder anderen Fehlern liegen.

Eine anschließende Gelelektrophorese prüft, ob ein Produkt ungefähr die erwartete Länge hat. Eine Bande der richtigen Länge allein beweist jedoch noch nicht die exakte Basenfolge. Dafür können weitere Analysen nötig sein.

PCR, RT-PCR und qPCR unterscheiden

Begriff	Was ist gemeint?
PCR	Vervielfältigung eines DNA-Abschnitts.
RT-PCR	RNA wird zuerst durch reverse Transkriptase in komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben. Danach folgt PCR. RT steht hier für reverse Transkription.
qPCR / Real-Time-PCR	Die Zunahme des Produkts wird während der Zyklen über ein Fluoreszenzsignal verfolgt. Unter passenden Bedingungen lässt sich auf die Ausgangsmenge schließen.
RT-qPCR	Kombiniert die Umschrift von RNA mit der quantitativen Echtzeitmessung.

Länge ist nicht Reihenfolge.

Lösung anzeigen

Nein. Verschiedene DNA-Sequenzen können gleich lang sein. Die Längenkontrolle allein bestimmt keine Sequenz.

Kurzer Begriffscheck

Was legt vor allem fest, welcher Bereich vervielfältigt wird?

Wähle eine Antwort.

Für den Unterricht

Einstieg: Natürliche Replikation und PCR vergleichen: Enzyme, Primer und Strangtrennung zuordnen.

Modellarbeit: Primer auf zwei antiparallelen Papiersträngen so platzieren, dass ihre 3′-Enden nach innen zeigen.

Auswertung: Mit der folgenden Gelseite die Bedeutung von Positiv- und Negativkontrolle erarbeiten.

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Mit DNA-Banden die Länge von Produkten prüfen.

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Fachliche Vertiefung: NHGRI · PCR · OpenStax · Biotechnology. Eigene Modellzeichnungen und Aufgaben. Umfang und Klassenstufe unterscheiden sich nach Bundesland und Schulart.

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