Chemie · Verstehen und üben

Elektrophorese und isoelektrischer Punkt

Von der funktionellen Gruppe zur Wanderrichtung: Verstehe, wie pH-Wert und Ladung die Trennung von Aminosäuren und Proteinen bestimmen.

pH < pI: + · pH > pI: −

Struktur · Ladung · Trennung

Die Ladung einer Aminosäure hängt vom pH-Wert ab

Elektrophorese trennt geladene Teilchen durch ihre Wanderung in einem elektrischen Feld. Bei Aminosäuren und Proteinen bestimmt der pH-Wert mit, welche Gruppen protoniert sind – und damit, in welche Richtung sie wandern.

Glycin besitzt eine Aminogruppe und eine Carboxylgruppe. In der gezeigten Zwitterionenform trägt es gleichzeitig eine positive Ammoniumgruppe –NH₃⁺ und eine negative Carboxylatgruppe –COO⁻. Ihre Ladungen ergeben zusammen null.

Vorwissen: Aminosäuren und Proteine. Eine Gesamtladung von null bedeutet nicht, dass keine geladenen Gruppen vorhanden sind.

Protonenabgabe verändert die Gesamtladung

H₃N⁺–CH₂–COOH ⇌ H₃N⁺–CH₂–COO⁻ + H⁺

H₃N⁺–CH₂–COO⁻ ⇌ H₂N–CH₂–COO⁻ + H⁺

Saurer · mehr protoniert

Bei sehr niedrigem pH überwiegt die Form mit –NH₃⁺ und –COOH: Gesamtladung +1.

Dazwischen · Zwitterion

Zuerst gibt die Carboxylgruppe ein Proton ab. –NH₃⁺ und –COO⁻ gleichen sich aus.

Basischer · weniger protoniert

Bei sehr hohem pH gibt auch –NH₃⁺ ein Proton ab. Mit –NH₂ und –COO⁻ beträgt die Gesamtladung −1.

Ein Gleichgewicht

Die Formen wechseln nicht schlagartig. Je nach pH liegen unterschiedliche Anteile gleichzeitig vor; entscheidend ist die mittlere Ladung.

H⁺ ist die Kurzschreibweise für hydratisierte Protonen. Die C–N- und C–C-Bindungen des Glycins bleiben bei diesen Säure-Base-Reaktionen erhalten.

Der isoelektrische Punkt ist ein bestimmter pH-Wert

Am isoelektrischen Punkt pI ist die mittlere Nettoladung eines Ampholyten null. Ohne weitere Transporteffekte gibt es dann keine gerichtete elektrophoretische Wanderung. Diffusion findet weiterhin statt.

pH kleiner als pI

Im Mittel positiv → zum negativen Pol, der Kathode.

pH größer als pI

Im Mittel negativ → zum positiven Pol, der Anode.

Glycin: pI ≈ (pKₛ₁ + pKₛ₂) / 2 = (2,34 + 9,60) / 2 = 5,97

Für Glycin mittelt man die zwei pKₛ-Werte, zwischen denen die ungeladene Gesamtform liegt. Bei Aminosäuren mit ionisierbarer Seitenkette müssen die passenden beiden Werte gewählt werden. Bei Proteinen müssen viele titrierbare Gruppen berücksichtigt werden; die einfache Glycinformel genügt dort nicht.

Ladungs-Labor: Wohin wandert Glycin?

Stelle den pH-Wert ein. Die Anteile werden aus pKₛ₁ = 2,34 und pKₛ₂ = 9,60 berechnet. Die Position zeigt nur die Richtung, keine messbare Laufstrecke.

pH-Wert 5,97

Am pI: keine gerichtete elektrophoretische Wanderung.

Struktur der überwiegenden Form; e bezeichnet die positive Elementarladung.

Anteile der Formen

Mittlere Ladung

Die mittlere Ladung beschreibt ein Ensemble. Ein einzelnes Glycin-Teilchen trägt hier +1, 0 oder −1.

So liest du ein Trennbild

Eine Probe wird auf einer Startlinie aufgetragen. Ein Puffer hält den pH möglichst konstant. Nach Anlegen der Spannung wandern die Stoffe entsprechend ihrer Ladung; im Gel beeinflussen auch Größe, Form und Porenstruktur die Geschwindigkeit.

Bei pH 7: A mit pI 5 → rechts · B mit pI 9 → links · C mit pI 7 → an der Startlinie

Die Positionen sind ein Richtungsmodell. Aus pI und pH allein lässt sich keine genaue Laufstrecke oder Stoffidentität ableiten.

Native Elektrophorese, SDS-PAGE und Fokussierung

Native Elektrophorese

Die natürliche Ladung und räumliche Form bleiben weitgehend erhalten. Ladung, Größe und Form beeinflussen die Trennung.

SDS-PAGE

SDS denaturiert Proteine und verleiht ihnen eine ungefähr gleichmäßige negative Ladung pro Masse. Im Gel erfolgt die Trennung überwiegend nach Größe; kleinere Proteine laufen meist weiter.

Isoelektrische Fokussierung

In einem pH-Gradienten wandert ein Protein bis zur Stelle pH = pI. Links und rechts davon ändert sich seine Ladung so, dass es zu dieser Stelle zurückwandert.

DNA als Vergleich

Für den Unterricht: Struktur → Ladung → Wanderung

Einstieg: Ladungen im Glycin-Zwitterion markieren.
Partnerarbeit: Vor jedem pH-Wechsel die Wanderrichtung vorhersagen.
Sicherung: Ein Trennbild mit gegebenen pI-Werten erklären und Grenzen der Aussage benennen.

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Grundlagen: funktionelle Gruppen, Zwitterionen und Peptidbindung. Ergänzung zur Elektrophorese.

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Ergänzende Übungen zu Aminosäuren und Proteinstruktur; kein spezielles Elektrophorese-Blatt.

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